细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）在生物医学研究中扮演着越来越重要的角色。它们不仅是细胞间通信的关键介质，还具有作为生物标志物和治疗剂的巨大潜力。然而，EV研究的复杂性也带来了诸多挑战，尤其是在EV的分离、表征和功能研究方面。国际细胞外囊泡学会（ISEV）发布的研究指南MISEV2023，为EV研究提供了全面的指导和建议。

细胞外囊泡（EVs）是由细胞释放的颗粒，具有脂质双层膜结构，大小从纳米到微米不等。它们在细胞间通信中发挥重要作用，能够携带蛋白质、脂质和核酸等生物分子。

·样本来源：EV可以从多种生物样本中分离，包括细胞培养上清、血液、尿液、脑脊液等。不同来源的EV具有不同的生物学特性和应用价值。

·预处理步骤：在EV分离前，需要对样本进行适当的预处理，以去除细胞碎片、血细胞、血小板等杂质。例如，通过低速离心去除细胞，使用过滤器去除大颗粒杂质。

·差速超速离心：这是目前最常用的EV分离方法，通过一系列离心步骤去除细胞碎片和杂质，最终通过超速离心沉淀EV。该方法能够获得较高纯度的EV，但耗时较长。

·密度梯度分离：利用EV与杂质在密度上的差异，通过密度梯度离心将EV与其他成分分离。该方法可以获得较高纯度的EV，但操作复杂，耗时较长。

·尺寸排阻色谱：基于EV的大小与杂质的差异，通过多孔介质将EV与其他成分分离。该方法温和，能够保留EV的生物活性，但分离效率相对较低。

·免疫亲和分离：利用特异性抗体捕获EV表面的标志物（如CD9、CD63、CD81），从而实现EV的分离。该方法快速高效，但可能会引入抗体污染，影响后续分析。

·粒子数量浓度：通过纳米粒子追踪分析（NTA）、电阻脉冲传感（RPS）等技术，可以定量分析EV的粒子数量浓度。这对于EV的定量研究和质量控制具有重要意义。

·大小分布：利用NTA、动态光散射（DLS）等技术，可以获得EV的大小分布信息。EV的大小与其生物学功能密切相关，不同大小的EV可能携带不同的生物分子。

·总蛋白和脂质含量：通过比色法、荧光法等方法，可以测定EV的总蛋白和脂质含量。这些指标有助于评估EV的产量和纯度。

·RNA含量：EV携带的RNA在生物信息传递中具有重要作用。通过qPCR、RNA测序等技术，可以分析EV中的RNA种类和含量。

·形态学分析：透射电子显微镜（TEM）、扫描电子显微镜（SEM）等技术可以观察EV的形态特征，如形状、大小和膜结构。这些信息有助于了解EV的生物合成和功能机制。

·剂量-反应研究：通过改变EV的剂量，观察其对受体细胞或生物系统的生物学效应，以评估EV的功能和作用机制。例如，研究不同浓度的EV对细胞增殖、迁移、分化等的影响。

·时间-过程研究：观察EV在不同时间点对受体细胞或生物系统的生物学效应，以了解EV作用的动态过程和持续时间。例如，研究EV在细胞内摄取、转运和释放的动态过程。

·阴性对照设置：使用适当的EV阴性对照和非EV对照，排除背景EV或非EV成分对实验结果的影响。例如，使用未处理的培养基或细胞裂解物作为EV阴性对照，使用非特异性抗体捕获的颗粒作为非EV对照。

·预分析因素影响评估：研究EV分离、存储和制备过程中的各种因素（如离心条件、存储温度、制备方法等）对其功能的影响，以优化EV的制备和应用。例如，评估不同分离方法对EV活性和功能的影响，选择最佳的分离条件以获得具有高活性的EV。

以上是EV研究的核心内容，涵盖了从定义、样本处理、分离、表征到功能研究的各个方面。掌握这些核心内容，就完成EV的快速入门学习咯！